SOS phages

Une bactérie infectée par un phage pourra donner au bout de 2 h 30 environ 100 millions de phages

Virus des bactéries, les phages sont, pour la grande majorité des fromagers, synonymes de problèmes d’acidification avec tous les effets collatéraux induits.

L

a mise en œuvre de micro-organismes, pour l’acidification du lait puis du caillé, est l’un des fondements de la fromagerie. De la régularité de leur développement dépend en partie la qualité des fromages. Mais les bactéries peuvent être attaquées par des bactériophages (virus pouvant infecter les bactéries), communément appelés « phages ». L’acidification prendra alors du retard, voire pourra même être stoppée dans les cas les plus graves.

Les retards d’acidification dus à des phages sont bien plus fréquents que ceux liés à la présence d’antibiotiques ou à la présence résiduelle de produits de nettoyage et de désinfection dans les cuves.

1. Le mode d’action des phages

Les bactériophages (figure 1) sont des virus capables d’infecter de manière spécifique les bactéries. En se multipliant, la plupart d’entre eux entraînent la mort des bactéries cibles (lyse cellulaire) de façon très rapide : au bout d’une vingtaine de minutes.

La lyse des bactéries libère des dizaines voire des centaines d’autres phages, qui peuvent à leur tour infecter d’autres bactéries. En cas de contamination, le nombre de phages augmente donc très vite. Il est multiplié par près de 100 pour chaque doublement de la population bactérienne (soit une génération) lorsque celle-ci est infectée. Dans les conditions optimales de développement des bactéries lactiques, une bactérie infectée par un phage donnera au bout de 2 h 30 environ 100 millions de phages !

Ainsi, réduire la dose de l’inoculation d’un ferment par deux est une mauvaise idée par rapport au risque phages. Il faut alors une génération supplémentaire pour obtenir le pH cible, ce qui rend l’exposition au risque phages plus élevée.

Les phages ne peuvent se reproduire sans utiliser une cellule hôte, ils sont considérés à ce titre comme des parasites. De plus, ils sont capables de rester en phase de « dormance » pendant des mois, parfois même des années, avant de se réactiver.

Figure 1 : Représentation schématique de la structure d’un phage de Lactococcus lactis (adaptée de Bebeacua et al 2013). Un phage est généralement composé de trois parties  :➜ une tête renfermant de l’ADN (pour 95% des phages connus) ou de l’ARN, ➜ un col, ➜ une queue constituée d’une gaine contractile, ➜ une plaque terminale sur laquelle se trouve les « points d’accroche ».


Les conséquences d’une attaque

La lyse cellulaire induite par les phages va se traduire par plusieurs effets.
➜ Une augmentation du temps d’acidification pour atteindre le pH cible recherché, voire dans certains cas un arrêt total de l’acidification (surtout lors de l’emploi de ferments en souche unique).
➜ Une augmentation des risques de post-acidification car les sucres résiduels seront en quantité plus importante.
➜ Une modification de la texture des fromages liée à une modification de la courbe pH versus égouttage.
➜ Une augmentation du risque de présence de micro-organismes indésirables, l’effet protecteur du pH étant obtenu avec retard.
➜ Des défauts de flaveur au niveau du produit fini, conséquences des changements métaboliques et de la composition des fromages (minéralisation….).

Lorsqu’ils présentent la facture

A

titre d’exemple, une froma­ge­rie qui produit 1 000 tonnes de pâtes pressés non cuite par an (environ 3 000 kg de fromages par jour) et qui est exposée à un risque moyen de phage (défaut d’acidification à raison de 2 jours par mois pendant lesquels il faut augmenter la dose de ferments pour compenser le retard d’acidification), peut perdre jusqu’à 35 000 euros par an de revenus liés au déclassement de produits, à la perte de productivité et au surcoût des ferments. Cette somme peut rapidement atteindre les 200 000 euros si le risque de phage est élevé au sein de la fromagerie (un risque élevé signifie que 25% des productions sont perturbées par les phages). ◼

2. D’où viennent-ils ?

En fromagerie, les phages se concentrent en particulier dans tous les endroits où les micro-organismes sont présents et se développent. Ils peuvent provenir de plusieurs sources.

➜ De l’environnement même de la fromagerie : sols, eau, air, égouts…

➜ Du lait ou de ses dérivés, en particulier le lactosérum et les crèmes de sérums. Les milieux de culture utilisés pour la confection de levains sont également une source potentielle de phages selon leur origine. Une base intégrant du lactosérum présentera plus de risques qu’une base lait. A noter qu’une pasteurisation à 72-74°C pendant 15 à 20 secondes ne permet pas de les éliminer. Un traitement à 92°C pendant 6 minutes ne détruit en moyenne que 82% des phages présents dans un lactosérum.

➜ Des équipements insuffisamment nettoyés/désinfectés comme les tanks de maturation, la ligne de pasteurisation, surtout si celle-ci est commune au lait et au lactosérum. La station de nettoyage en place (NEP) peut également être une source de contamination, en particulier si la fromagerie est équipée d’une station unique pour l’ensemble de l’atelier. L’idéal est que la NEP de la ligne lait soit dissociée de la NEP lactosérum.

➜ De contaminations croisées liées à un aménagement non adapté des locaux : salle de fabrication des ferments en dépression par rapport à la salle de fabrication, pas de différence de pression entre la salle de fabrication et les zones de gestion/stockage des lactosérums…

➜ De la réutilisation de crèmes de lactosérum, de protéines micro-particulées en cas de traitements thermiques ne permettant pas l’inactivation totale des phages. Prévoir, à titre d’exemple, 90°C pendant 30 minutes pour les lactosérums.

Les phages ralentissent l’acidification et peuvent même la stopper totalement

3. Diagnostiquer une attaque

Le premier signe visible d’une attaque phagique est un retard d’acidification lors de la fabrication, voire un arrêt complet de celle-ci. La courbe d’acidification obtenue en comparaison avec la courbe de référence peut donner une indication du niveau d’exposition aux phages. Les phages peuvent aussi attaquer, en plus des ferments acidifiants, les ferments aromatiques ; dans ce cas, le diagnostic est plus difficile à établir.

Il existe différentes méthodes pour évaluer la présence de phages. Certaines peuvent être utilisées en routine, comme les tests d’inhibition, tandis que d’autres sont plus adaptées aux investigations de recherche : ATP-métrie, test PCR, microscope électronique. Les tests d’inhibition consistent à comparer la réponse d’acidification d’une souche ou d’un ferment dans des conditions de référence (non infectée) et dans des conditions suspectées d’être infectées par des phages. Ils peuvent être réalisés :

➜ Soit dans des tubes à essais avec évaluation de l’écart de pH entre la condition référence et la condition suspectée.

Delta pH < 0,1 Pas d’inhibition
0,1 < Delta pH < 0,3 Faible inhibition
0,3 < Delta pH < 0,6 Inhibition modérée
Delta pH > 0,6 Forte inhibition

➜ Soit en suivi continu du pH (type Cinac). Selon les courbes obtenues, l’inhibition sera définie comme absence d’inhibition, inhibition faible, modérée ou forte (cf figure 2).

Figure 2 : Exemple d’interprétation de l’inhibition due à des phages en suivant la courbe pH.

4. Evaluer le risque d’exposition

Selon les pratiques et la conception de chaque fromagerie, il est possible d’évaluer le risque d’exposition aux phages. Le risque peut être considéré comme élevé si les différents points ci-dessous conjuguent leurs effets.

Absence de rinçage entre deux remplissages de cuve. L’idéal est d’avoir un lavage et une désinfection systématiques entre deux remplissages. Cette absence de pratique et la mise en œuvre d’un unique rinçage superficiel augmentent fortement le niveau de risque.

Absence de nettoyage et de désinfection intermédiaire pendant une journée entière de fabrication.

Recyclage des crèmes de sérum et/ou de protéines micro-particulées issues d’une fabrication mettant en œuvre les mêmes ferments que ceux utilisés pour la fabrication du fromage.

Utilisation d’une ligne de nettoyage en place (NEP) unique pour l’ensemble des produits : lait, produits finis et lactosérums.

Conception non adaptée des locaux qui ne permet pas de limiter les contaminations croisées entre le lait et le lactosérum, mais également au niveau des flux d’air. La mise en place d’une cascade de surpression entre les pièces à risque élevé (salle de préparation des ferments) et à risque faible permet de limiter les accidents.

Nombre important de rotations réalisées par jour au sein de la même cuve avec les mêmes ferments. Au-delà de cinq, les risques commencent à augmenter.

Utilisation de cuves ouvertes : il accentue les risques par rapport à des cuves fermées.

Différentes méthodes permettent de détecter des phages, en cas de suspicion ou en routine

5. Prévenir les risques

Le bon sens s’impose. Il faut absolument commencer chaque jour de fabrication avec un nombre initial de phages le plus faible possible. Plus la charge initiale est élevée, plus le risque d’apparition d’un problème d’acidification sera important et plus celui-ci apparaîtra rapidement au cours de la journée. Cette réduction du nombre initial dépend des pratiques d’hygiène et de désinfection mises en œuvre et du non-recours à la recirculation des lactosérums et des crèmes de sérum. Il faut ensuite réduire leur prolifération en évitant les contaminations croisées, en respectant les doses d’emploi des ferments, en mettant en place des nettoyages/désinfections entre chaque remplissage de cuve et en respectant les bonnes pratiques relatives aux rotations des cultures. Exemples.

➜ Lors de l’utilisation d’un ferment multi-souches complexe : si le risque d’exposition est faible, une rotation toutes les deux semaines est en général une bonne pratique. En revanche, si le risque est élevé, il faudra la mettre en place tous les deux à trois jours.

➜ Lors de l’utilisation de ferments composés d’un nombre limité de souches (3 à 5), si le niveau d’exposition est faible, un programme de rotation tous les 2 à 3 jours est un bon ordre de grandeur. Si le risque est élevé, réaliser une rotation chaque jour.

➜ Dans tous les cas, il est fortement conseillé de se rapprocher de son fournisseur de ferments pour mettre en œuvre les bonnes pratiques de rotation, celles-ci étant spécifiques à la conception des cultures mais aussi aux pratiques de la fromagerie.

L’utilisation d’un grand nombre de ferments ne constitue pas, souvent, la bonne solution. En effet, le risque de maintenir un bruit de fond sera plus important, surtout si le fromager ignore le niveau de sensibilité phagique des ferments entre eux (par exemple, si multiples fournisseurs…). Il faudra également faire attention lors de l’introduction d’une nouvelle culture, s’assurer qu’elle n’a pas de lien phagique avec les cultures déjà employées.
La prévention passera également par une bonne formation des employés qui mettent en œuvre les ferments afin de les initier aux bonnes pratiques et limiter la diffusion des phages entre les différents locaux. Enfin, la réalisation d’audits phages et la mise en place de suivis réguliers permettant d’évaluer la pression phagique sont indispensables. Pour cela, il ne faut pas hésiter à contacter son fournisseur de ferments.

L’utilisation d’un grand nombre de ferments ne constitue pas, souvent, la bonne solution

6. Tous concernés ?

Il existe une très grande diversité de situations. Par exemple, deux fromageries utilisant les mêmes ferments, dans une même technologie fromagère, peuvent présenter des profils au risque phages très éloignés. Une fromagerie pourra travailler pendant des années sans aucun problème tandis qu’une autre aura des accidents et retards d’acidification plus d’une fois par mois. Dans ce cas, les pratiques d’hygiène et l’organisation du travail sont à revoir.

Certains ferments sont également plus sensibles que d’autres. Cela peut être lié à la diversité des souches du ferment, mais aussi à la résistance aux phages de ces souches. Il ne s’agit donc pas toujours une question de nombre de souches. ◼

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